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带你了解ELISA(入门篇)

发布时间:2017-05-31 16:17:50 分类:新闻动态 来源: 点击:

带你了解ELISA(入门篇) 带你了解ELISA(入门篇) 1.实验目的 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的1种新型的免疫测定技术,ELISA进程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被,加待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原),生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物,再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。 2.实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多,如过氧化物酶,碱性磷酸酯酶,β-D-半乳糖苷酶,葡萄糖氧化酶,碳酸酐酶,乙酰胆碱酯酶,6-磷酸葡萄糖脱氧酶等。经常使用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶,碱性
1.实验目的
酶联箱包跌落试验机免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzyma橡胶轮式磨损试验机tic techniques)的基础上发展起来的1种新型的免疫测定技术,ELISA进程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被,加待测抗体(抗土体三轴流变试验机原), 再加相应酶标记抗体(抗原),生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物,再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。


2.实验原理
用于免疫酶技术的酶有很多,如过氧化物酶,碱性磷酸酯酶,β-D-半乳糖苷酶,葡萄糖氧化酶,碳酸酐酶,乙酰耐流尘试验机胆碱酯酶,6-磷酸葡萄糖脱氧酶等。经常使用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶,碱性磷酸酯酶等,其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的塑料弯曲试验机是氧化还原反应,在呈色后须立刻测定,否则空气中的氧化作用使色彩加深,没法准确地定量。
辣根过氧化物酶(HRP)是1种糖蛋白,每一个份子含有1个氯化血红素(protonhemin)区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm,HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm,所以酶的浓度和纯度计算式是(已知HRP马朗式机械安定度试验机的A(1cm 403nm 1%)=25,式中1%指HRP百分浓ld震动试验机度为100ml含酶蛋白1g,即10mg/ml,所以,酶浓度以 mg/ml 计算是双柱拉力试验机HRP的软床垫耐久性试验机A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP纯度(RZ)=A403nm/A275nm纯度RZ(Reinheit Zahl)值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右,最高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。

ELISA的基本原理有3条: (1)抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面,多是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部份相互吸附,并保持其免疫学活性; (2)抗原或抗体可通过共价键与酶连接构成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性; (3)酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的色彩反应来判定是不是有免疫反应的存在,而且色彩反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,因此,可以高压爆破试验机按底物显色的程度显示实验结果。
ELISA法是免疫诊断自行车弹簧试验机中的1项新技术,现已成功地利用于多种病原微生物所引发的沾染病、寄生虫病及非沾染病等方面的免疫诊断。也已利用于大份子回弹性能试验机抗原和小份子抗原的定量测定,根据已使用的结果,认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不但适用于临床标本的检查,而且由于1包装压缩试验机天以内可以检查几百乃至上千份标本,因此,也合适于血清流行病学调查。本法不但可以用来测定抗体,而且也可用于测定体液中的循环抗原,所以也是1种初期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的利用范围日趋扩大,可概括4个方面: 1、免疫酶染色各种细胞内成分的定位。 2、研究抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成分。

基本方法1 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:  1. 包被:用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每一个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃过1夜。第二天,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。(简称洗涤,下同)。  2. 加样:加1定稀箱包行走颠簸磨耗试验机释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔,阴性对比孔及阳不干胶剥离强度试验机性对比孔)。  3. 加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5~1小时,洗涤。管道耐压试验机  4. 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分钟。  5. 终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。  6. 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼视察结果:反应孔内色彩越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,根据所呈色彩的深浅,以“+”、&l微机控制冲击试验机dquo;-”号表示。也可测O·D值:在ELISA检测气驱试验机仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,以空白对比孔调零后测各孔O·D值,若大于规定的阴性对比OD值的2.1倍,即为阳性。

基本方法2 用于检测未知抗体的间接法:用包被缓冲液将已知抗原稀释至1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃过1夜。第二天洗涤3次。↓加1定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对比)↓于反应孔中,加入新鲜稀释的酶标第2抗体(抗抗体)0.1ml,37℃孵育30⑹0分钟,洗涤,钢材拉力试验机最后1遍用DDW洗涤。↓其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

(2)酶与底物
酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂,它不但具有抗体抗原特异的免疫反应,还具有酶促反应,显示诞生物放大作用,但不同的酶选用不同的底物。
免疫技术经常使用的酶及其底物



底物
显色反应
测定波长
辣根过氧化物酶
邻橡胶辊筒磨耗试验机苯2胺
橘红色
492*
4甲替联苯胺
黄色
460**
氨基水杨酸
棕色
449
邻联苯甲胺
兰色
425
2,2'-连胺基⑵(3-乙基-并噻唑啉磺酸⑹)铵盐
蓝绿色
642
碱性磷酸酯酶
4-硝基酚磷OCSTPU挤出试验机酸盐(PNP)
黄色
400
萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
红色
500
葡萄糖氧化酶
ABTS+HRP+葡萄糖
黄色
405,420
葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
深蓝色
β-D-半乳糖苷酶
甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)
荧光
360,450
硝基酚半乳糖苷(ONPG)
黄色
420


*终止剂为2mol/L H2SO4
** 终止剂为2 mol/L柠檬酸,不同的底物有不同的终止剂。
可催化以下反应: HRP+H2O2→复合物复合物+AH2→过氧化物酶+H2O+A AH2 ——为无色底物, 供氢体; A——为有色产物。

(3) ELISA经常使用的4种方法

1.直接法测定抗原
将抗原吸附在载体表面;
加酶标抗摆锤冲击试验机抗体,构成抗原—抗体复合物;
加底物。底物的降解量=抗原量。

2.间接法测定抗体
将抗原吸附于固相载体表面;
加抗体, 构成抗原-抗体复合物;
加酶标抗体;
加底物。测定底物的降解量=抗体量。线材弯曲试验机

3.双抗体夹心法测定抗原
将抗原免疫第1种动物取得的抗体吸附于固相表面;
加抗原,构成抗原-抗体复合物;
加抗原免疫第2种动物取得的抗体,构成抗体抗原抗体复合物;
加酶标抗抗体(第2种动物抗体的抗体塑料管环刚度试验机);
加底物。底物的降解量=抗原量。

4. 竞争法测定抗原
将抗体吸附在固相载体表面;
(1) 加入酶标抗原;
(2),(3)加入酶标抗原和待测抗原;
加底物。对比孔与样品孔底物降解量的差=未知抗原量。

3.仪器和材料

1. 聚苯乙烯微量细胞培养板(平板, 40, 96孔)。
2. 酶联免疫检测仪
3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀释度1:1000。
4. 包被液::0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4℃,保存, Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml。
5. 稀释液:0.01mol/LpH7.4 PBS--Tween-⑵0, 4℃,保存. NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g, Tween—20,0.5ml. 蒸馏水加至1000ml。
6. 洗涤液:同稀释液
7. 封闭液:0.5%鸡卵清蛋白,pH7.4 PBS。
8. 邻苯2胺溶液(底物):临用前配制紫外试验机 0.1M 柠檬酸(2.1g/100ml), 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O (7.163g/100ml) 6.4ml, 蒸馏水12.5ml, 邻苯2胺10mg, 溶解后, 临用前加30%H2O2 40 微升。
9单柱万能试验机. 终止液:2mol/LH2SO4。

4.操作步骤
1. 包被抗原:用包被液将抗原作适当稀释, 1般为1~10微克/孔,每孔加200微升,37℃温育1小时后,4℃冰箱放置16~18小时。
2. 洗涤:倒尽板孔中液体,加满洗涤液,静放3分钟,反复3次,最后将反应板颠倒在吸水纸上,使孔中洗涤液流尽。
3. 加封闭液200微升,37℃放置1小时。
4. 洗涤同2。
5. 加被检血清:用稀释液将被检血清作几种稀释,,每孔200微升。同时作稀释液对比。37℃放置2小时。
6. 洗涤同2。
7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃ 1小时。
8. 洗涤同2。
9. 加底物:邻苯2胺溶液加200ml,室温暗处10-⑴5分钟。
10. 加终止液:每孔50微升。
11. 视察结果:用酶联免疫检测仪记录490nm读数。